Tras la muerte de Berardi en 1496, Vespucio tomó las riendas de los negocios y pudo disponer de los bienes necesarios para organizar una expedición a la India. Formó parte de la flota española compuesta por 4 naves que en 1499 partió del puerto de Cádiz. Siguiendo la ruta del tercer viaje de Colón, recorrió la costa norte de Sudamérica. Cuando el grupo tocaba las costas de Guyana, Vespucio navegó hacia el Sur, convencido que era el litoral oriental de Asia. Descubrió la desembocadura del río Amazonas y avanzó hasta el Cabo Consolación o de San Agustín en las costas de Brasil. De aquí regresó y reconoció la desembocadura del río Orinoco, paso por Trinidad y por La Española.

De regreso a España trató de convencer a la corona española para que auspiciaran una nueva expedición. Sin embargo no obtiene el apoyo requerido, pues sería incumplir con el Tratado de Tordesillas, marchó a Portugal y se puso al servicio del rey Manuel de Portugal, quien lo apoyó en su segunda travesía. Partió de Lisboa con 3 naves. Tocaron tierra firme y continuaron recorriendo la costa actual de Brasil hasta entrar en la bahía de Río de Janeiro. De aquí continuó su viaje hacia el sur llegando a la Patagonia cerca del estrecho que poco después descubriría Fernando de Magallanes.

Vespucio regresó de este viaje convencido que las tierras descubiertas no eran parte de Asia sino un nuevo continente. Este viaje y sus ideas fueron descritos por Vespucio en una carta que dirigió a Lorenzo de Pier Francesco Dei Medici, primo de Lorenzo el Magnífico, y editada en París en 1502 con el título de Mundus Novus.

La noticia del descubrimiento de un nuevo continente se difundió con gran rapidez en toda Europa. El cosmógrafo alemán Martin Waldssemüler hizo mención a las noticias dadas por Vespucio en su Cosmographiae introductivo, preparada y publicada en 1507 por la abadía de Saint Dié, en Lorena (Francia).

A partir de entonces comenzó a tomar fuerza el nombrar al nuevo continente como Americus o América en honor a Vespucio.